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リアルタイム RT-PCR による 2019-nCoV の診断検出
-2020 年 1 月 17 日時点のプロトコルと予備評価-
Victor Corman、Tobias Bleicker、Sebastian Brünink、Christian Drosten
Charité Virology、ベルリン、ドイツ
Olfert Landt、Tib-Molbiol、ベルリン、ドイツ
Marion Koopmans
Erasmus MC、ロッテルダム、オランダ
Maria Zambon
Public Health England、ロンドン
Malik Peiris、香港大学による追加アドバイス
ワークフロープロトコルをお探しのユーザーは、このドキュメントの最後の 3 ページを参照してください
連絡先: christian.drosten@charite.de
https://virologie-ccm.charite.de/en/
陽性コントロールマテリアルは、ベルリンの Charité から EVAg 経由で入手できます
(https://www.european-virus-archive.com/)。
これは文書バージョン 2 です。
バージョン 1 (2019 年 1 月 13 日) からの変更点: ワークフロープロトコルの追加、N 遺伝子アッセイの削除、RdRp アッセイの単一プローブバージョンのデータの追加、コントロールの可用性に関する情報の更新。
GISAID (www.gisaid.org) の配列の作成者: 中国国立ウイルス病予防管理研究所、中国医学科学院病原体生物学研究所、中国北京協和医学院、中国中国科学院武漢金銀潭病院ウイルス学研究所。
別の配列 (MN908947) の公開については、中国上海の復旦大学上海公衆衛生臨床センターおよび公衆衛生学院の Yong-Zhen Zhang 教授に感謝の意を表します。
「SARS関連コロナウイルス」という用語には、SARSウイルスだけでなく、旧北区全域の（主に）キバナコウモリに関連することが知られているベータコロナウイルスの系統群も含まれています。最新の分類では、これらのウイルスはサルベコウイルスと呼ばれる亜属に分類されています。

背景
既知の SARS および SARS 関連コロナウイルス (独自の研究および文献ソースからのコウモリウイルス) を使用して、重複のないアラインメントを作成しました (抜粋は付録に示されています)。2019-nCoV の最初のシーケンスが公開される前に、候補となる診断 RT-PCR アッセイを設計しました。シーケンスが公開されると、シーケンスアラインメントの検査と初期評価に従って、2019-nCoV との一致に基づいて次のアッセイが選択されました (図 1 および 2)。
すべてのアッセイで、SARS-CoV ゲノム RNA を陽性コントロールとして使用できます。2019-nCoV E 遺伝子アッセイの合成コントロール RNA は、EVAg から入手できます。2019-nCoV RdRp の合成コントロールは、1 月 21 日以降に EVAg から入手できる予定です。第一線スクリーニングアッセイ：E遺伝子アッセイ
確認アッセイ：RdRp遺伝子アッセイ
図1 SARS-CoVおよび2019-nCoVゲノム上のアンプリコンターゲットの相対位置。ORF：オープンリーディングフレーム、RdRp：RNA依存性RNAポリメラーゼ。アンプリコンの下の数字は、SARS-CoV、NC_004718に従ったゲノム位置です。
材料とアッセイ処方
臨床サンプルとCoV細胞培養上清
呼吸器サンプルは、2019年にシャリテ医療センターに入院した患者から採取され、NxTAG®呼吸器病原体パネル（Luminex）で検査され、MERS-CoVの場合は、以前に公開されたMERS-CoV upEアッセイで検査されました（1）。
分類されたコロナウイルスの細胞培養上清は、当社の研究室と臨床検査室で入手できました。型別鳥インフルエンザウイルス RNA (H5N1) は、ドイツ医療検査品質保証推進協会 (INSTAND) の熟練度試験パネルから入手しました。RNA は、MagNA Pure 96 システム (Roche) を使用して臨床サンプルから抽出し、ウイルス RNA ミニキット (Qiagen) を使用して細胞培養上清から抽出しました。
アッセイ設計
オリゴヌクレオチドの設計と in silico 評価のために、2020 年 1 月 1 日までに GenBank で入手可能な SARS 関連ウイルスの完全および部分 (400 ヌクレオチドを超える場合) 配列をすべてダウンロードしました。リスト (n=729 エントリ) は手動でチェックされ、人工配列 (ラボ由来、合成など) と配列の重複が削除され、最終的に 375 個のリストが作成されました。

配列。これらの配列は整列され、その整列がアッセイ設計に使用されました。
この整列は後に武漢クラスターからリリースされた配列によって補完されました。
現在リリースされているすべての配列はアンプリコンと一致しています (図 2)。
コウモリ関連の SARS 関連ウイルスのすべての固有配列におけるオリゴヌクレオチド結合部位の概要は、
付録に示されています。
リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
すべてのアッセイで同じ条件を使用しました。プライマーとプローブの配列、および最適化された濃度を表 1 に示します。25 μl の反応液がセットアップされ、5 μl の RNA、Superscript III ワンステップ RT-PCR システムで提供される 2 X 反応バッファー 12.5 μl (Platinum Taq ポリメラーゼ (Invitrogen、各デオキシリボヌクレオチド三リン酸 (dNTP) 0.4 mM および 3.2 mM 硫酸マグネシウムを含む)、キットからの逆転写酵素/Taq 混合物 1 μl、50 mM 硫酸マグネシウム溶液 0.4 μl (Invitrogen – キットには付属していません)、および非アセチル化ウシ血清アルブミン 1 μg (Roche) が含まれています。すべてのオリゴヌクレオチドは、ベルリンの Tib-Molbiol によって合成され、提供されました。逆転写のために熱サイクルを 55°C で 10 分間実行し、続いて 95°C で 3 分間実行し、その後 95°C で 15 秒間、58°C で 30 秒間を 45 サイクル実行しました。